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 　　這是在µ-Slide Chemotaxis細(xì)胞趨化載玻片中進(jìn)行3D趨化性實(shí)驗(yàn)后，對(duì)嵌入Matrigel®中的HUVEC（人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞）進(jìn)行免疫熒光染色的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)方案。在Matrigel®中，趨化性細(xì)胞向10％FCS遷移之后，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)染色研究了定向細(xì)胞遷移的形態(tài)學(xué)特征。

　　01、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備

　　µ-Slide Chemotaxis

　　02、實(shí)驗(yàn)步驟

　　將HUVEC接種在50％Matrigel®中，并填充至µ-Slide Chemotaxis中，然后將其沿10％FCS梯度遷移24小時(shí)。采用免疫染色法觀察內(nèi)皮細(xì)胞在Matrigel®中定向遷移后的形態(tài)學(xué)特征。HUVEC的染色是直接在µ-Slide細(xì)胞趨化載玻片中進(jìn)行的。在染色方案的所有步驟中，將60 µl的相應(yīng)溶液分別添加到兩個(gè)大儲(chǔ)液池中。在孵育過(guò)程中，所有塞子均保持關(guān)閉狀態(tài)，以免干擾通過(guò)觀察通道的擴(kuò)散。除非另有說(shuō)明，否則所有步驟均在室溫下進(jìn)行。

　　1) 從一邊儲(chǔ)液池中取出塞子，然后吸出培養(yǎng)基。在抽吸和沖洗步驟中，將塞子留在中央通道中。

　　2) 用1x PBS洗滌→3x 10分鐘

　　3) 用4％多聚甲醛固定細(xì)胞和基質(zhì)蛋白→1x 40分鐘

　　4) 用1x PBS洗滌→2x 10分鐘

　　5) 用0.2％Triton X-100 / PBS透化細(xì)胞→1x 20分鐘

　　6) 用1x PBS洗滌→6x 10分鐘

　　7) 用1% BSA/PBS阻斷非特異性抗原→過(guò)夜

　　8) 用1x PBS洗滌→6x 10分鐘

　　9) 添加一抗：?jiǎn)慰寺】筕E鈣黏著蛋白，小鼠（在1％BSA / PBS中為1：100）→在4°C下1x 24小時(shí)

　　10) 用1x PBS洗滌→6x 10分鐘

　　11) 添加二抗：山羊抗小鼠IgG（H + L），Alexa Fluor 680（在1％BSA / PBS中為1:50）→在4°C過(guò)夜

　　12) 用1x PBS洗滌→6x 10分鐘

　　13) 加入染色混合物→1x 40分鐘

　　i) 羅丹明phalloidin染色肌動(dòng)蛋白絲（PBS中1：400）

　　ii) Hoechst 33342對(duì)細(xì)胞核染色（1：100，PBS中0.5 µg/ml）

　　14) 用1x PBS洗滌→6x 10分鐘

　　15) 將最后的PBS留在儲(chǔ)液罐中并開(kāi)始成像。

　　免疫熒光圖像由LeicaSP8SMD共聚焦激光掃描顯微鏡獲得，配以63xHCPLAPO1.2NA水物鏡。用405nm紫外激光激發(fā)Hoechst 33342，594nmHeNe激光激發(fā)羅丹明-phalloidin，638nmHeNe激光激發(fā)AlexaFluor680。

　　重要提示:與標(biāo)準(zhǔn)染色方案相比，洗滌和染色步驟所需的培養(yǎng)時(shí)間更長(zhǎng)。這是為了確?？贵w通過(guò)凝膠充分?jǐn)U散。

　　03、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

　　HUVEC在Matrigel®基質(zhì)中的免疫染色顯示，相鄰的細(xì)胞組優(yōu)先形成細(xì)胞簇并作為集合體遷移。少數(shù)細(xì)胞呈單細(xì)胞遷移。

　　圖1：顯示HUVEC在50%Matrigel®中的多細(xì)胞趨化性的細(xì)胞簇。固定后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞核（藍(lán)色）、F-肌動(dòng)蛋白（紅色）和VE鈣粘蛋白（青色）染色。白色箭頭表示VE介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞接觸。

　　當(dāng)細(xì)胞作為個(gè)體遷移時(shí)，細(xì)胞體被拉長(zhǎng)，呈間充質(zhì)梭形。細(xì)胞呈前后極性，前緣呈小片狀，向梯度方向有突起。

　　當(dāng)以多細(xì)胞單元組織時(shí)，細(xì)胞團(tuán)簇表現(xiàn)出明顯的前后不對(duì)稱(chēng)的群極化（圖1）。在這里，一個(gè)或幾個(gè)前導(dǎo)細(xì)胞參與了前緣的形成，前緣表現(xiàn)出細(xì)長(zhǎng)的突起或?qū)挼钠瑢?。遷移復(fù)合體較深區(qū)域的連續(xù)細(xì)胞沒(méi)有極化。然而，這些細(xì)胞特征性地保留了VE鈣粘蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞接觸（圖1）。

　　04、訂購(gòu)信息