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　　1.詳情

　　細胞遷移在許多復雜的生理和病理過程中起著重要作用。傷口愈合測定是研究體外細胞遷移的簡單方法。該測定基于以下觀察：在匯合的單層中人工產生的間隙邊緣上的細胞將遷移直至建立新的細胞 - 細胞接觸。ibidi Culture-Insert 2 Well為傷口愈合實驗提供了完整的解決方案，從樣品制備到圖像分析只需要幾個步驟。

　　本應用簡報是使用ibidi Culture-Insert 2 Well 在24孔培養板上分析MCF-7細胞遷移實驗的詳細方案。并行測試了五種不同濃度的人表皮生長因子（hEGF）對遷移行為的影響并與對照條件進行比較。

　　2.材料

　　·細胞：MCF-7(ATCC:HTB-22;DSMZ: ACC115)

　　·ibidi實驗耗材：Culture-Insert 2 Well 24, ibiTreat (ibidi, 80242)

　　·細胞培養表面：ibiTreat

　　·細胞培養基：RPMI (Sigma, R8758) + 10% FCS (Sigma, F0804)

　　·細胞解離溶液：Trypsin-ETDA (Sigma, 59418C)

　　·生長因子：human epidermal growth factor (hEGF) (Promokine, C-60170)

　　·無菌鑷子

　　·倒置顯微鏡，最好具有自動圖像采集系統和用于活細胞成像的頂部培養箱

　　3.實驗工作流程

　　在該實驗中測試了hEGF對MCF-7細胞遷移行為的影響。使用五種不同的hEGF濃度，并將遷移行為與未用hEGF處理的對照細胞進行比較。

　　圖1實驗裝置：測試了五種不同的hEGF濃度（綠色）（5,10,20,30,40ng / ml）。未處理的細胞（白色）作為對照。對每種條件進行四次技術重復。

　　3.1 步驟1：細胞接種

　　正確的接種濃度是一個關鍵參數，因為24小時后應達到匯合的單層。需要進行預實驗以確定所用細胞系的最佳濃度。

　　1. 取下附在μ-Plate底部的保護膜（圖2A）。

　　2. 像往常一樣準備細胞懸液。建議包括離心步驟以去除死細胞和細胞碎片。將MCF-7細胞懸浮液調節至細胞濃度為5×105細胞/ml。

　　3. 將70μl細胞懸浮液應用于2孔的培養插件每個孔中（圖2B）。避免搖動μ-Plate，因為這會導致細胞分布不均勻。

　　4. 將細胞在37°C和5％CO2培養至少24小時。

　　圖2在開始細胞接種步驟（A）之前取下保護膜。將70μl細胞懸浮液填充到2孔培養插件（B）的每個孔中。

　　3.1 步驟2：劃痕形成

　　μ-Plate 24 Well的使用并行測試五種不同的hEGF濃度和對照條件。每種實驗條件可以進行四次技術重復（圖1).

　　1. 在顯微鏡下觀察培養24小時后的細胞密度。如果24小時后未達到融合細胞單層，則將μ-Plate于細胞培養箱中再培養幾個小時。定期檢查匯合點。

　　2. 將生長因子添加到細胞培養基中以獲得以下濃度：0,5,10,20,30和40ng / ml EGF。

　　3. 用無菌鑷子輕輕取出2孔培養插件。要移除培養插件，請抓住一個角，如圖3所示。

　　4. 用無細胞培養基或PBS洗滌細胞層以除去細胞碎片和未附著的細胞。

　　5. 小心吸出無細胞培養基或PBS。

　　6.用移液管將1ml細胞培養基加到24孔板的每個孔中。

　　圖3使用無菌鑷子取出2孔培養插件

　　3.1 步驟3：獲取顯微鏡圖像

　　我們建議錄制延時視頻，以確定時間依賴性和細胞遷移的特征。

　　1. 將μ-Plate 24孔培養板放在顯微鏡上并確定所有24個孔的位置。

　　2. 在接下來的幾個小時內多次拍攝圖像，開始觀察過程。在24小時內每30分鐘拍攝一次圖像。

　　4.結果

　　分析顯微圖像以獲得關于培養細胞遷移特征信息。分析細胞覆蓋區域隨時間的變化來確定細胞速度。

　　圖4 hEGF對MCF-7細胞遷移行為影響的比較。測試了四種不同的EGF濃度，并與對照實驗進行了比較。

　　使用Culture-Insert 2 Well 在24孔培養板上進行測試六種不同（或更多）的條件。通過比較細胞速度與對照條件的速度來分析五種不同hEGF濃度（每種重復四次）的影響。實驗數據顯示，與對照組相比，hEGF增加了MCF-7細胞的細胞速度。如圖4所示，hEGF> 10ng / ml的濃度顯示細胞速度沒有進一步增加。