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　　1.詳情

　　細(xì)胞遷移在許多復(fù)雜的生理和病理過程中起著重要作用。傷口愈合測(cè)定是研究體外細(xì)胞遷移的簡(jiǎn)單方法。該測(cè)定基于以下觀察：在匯合的單層中人工產(chǎn)生的間隙邊緣上的細(xì)胞將遷移直至建立新的細(xì)胞 - 細(xì)胞接觸。ibidi Culture-Insert 2 Well為傷口愈合實(shí)驗(yàn)提供了完整的解決方案，從樣品制備到圖像分析只需要幾個(gè)步驟。

　　本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)是使用ibidi Culture-Insert 2 Well 在24孔培養(yǎng)板上分析MCF-7細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)方案。并行測(cè)試了五種不同濃度的人表皮生長(zhǎng)因子（hEGF）對(duì)遷移行為的影響并與對(duì)照條件進(jìn)行比較。

　　2.材料

　　·細(xì)胞：MCF-7(ATCC:HTB-22;DSMZ: ACC115)

　　·ibidi實(shí)驗(yàn)耗材：Culture-Insert 2 Well 24, ibiTreat (ibidi, 80242)

　　·細(xì)胞培養(yǎng)表面：ibiTreat

　　·細(xì)胞培養(yǎng)基：RPMI (Sigma, R8758) + 10% FCS (Sigma, F0804)

　　·細(xì)胞解離溶液：Trypsin-ETDA (Sigma, 59418C)

　　·生長(zhǎng)因子：human epidermal growth factor (hEGF) (Promokine, C-60170)

　　·無菌鑷子

　　·倒置顯微鏡，最好具有自動(dòng)圖像采集系統(tǒng)和用于活細(xì)胞成像的頂部培養(yǎng)箱

　　3.實(shí)驗(yàn)工作流程

　　在該實(shí)驗(yàn)中測(cè)試了hEGF對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移行為的影響。使用五種不同的hEGF濃度，并將遷移行為與未用hEGF處理的對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行比較。

　　圖1實(shí)驗(yàn)裝置：測(cè)試了五種不同的hEGF濃度（綠色）（5,10,20,30,40ng / ml）。未處理的細(xì)胞（白色）作為對(duì)照。對(duì)每種條件進(jìn)行四次技術(shù)重復(fù)。

　　3.1 步驟1：細(xì)胞接種

　　正確的接種濃度是一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，因?yàn)?4小時(shí)后應(yīng)達(dá)到匯合的單層。需要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定所用細(xì)胞系的最佳濃度。

　　1. 取下附在μ-Plate底部的保護(hù)膜（圖2A）。

　　2. 像往常一樣準(zhǔn)備細(xì)胞懸液。建議包括離心步驟以去除死細(xì)胞和細(xì)胞碎片。將MCF-7細(xì)胞懸浮液調(diào)節(jié)至細(xì)胞濃度為5×105細(xì)胞/ml。

　　3. 將70μl細(xì)胞懸浮液應(yīng)用于2孔的培養(yǎng)插件每個(gè)孔中（圖2B）。避免搖動(dòng)μ-Plate，因?yàn)檫@會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分布不均勻。

　　4. 將細(xì)胞在37°C和5％CO2培養(yǎng)至少24小時(shí)。

　　圖2在開始細(xì)胞接種步驟（A）之前取下保護(hù)膜。將70μl細(xì)胞懸浮液填充到2孔培養(yǎng)插件（B）的每個(gè)孔中。

　　3.1 步驟2：劃痕形成

　　μ-Plate 24 Well的使用并行測(cè)試五種不同的hEGF濃度和對(duì)照條件。每種實(shí)驗(yàn)條件可以進(jìn)行四次技術(shù)重復(fù)（圖1).

　　1. 在顯微鏡下觀察培養(yǎng)24小時(shí)后的細(xì)胞密度。如果24小時(shí)后未達(dá)到融合細(xì)胞單層，則將μ-Plate于細(xì)胞培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)幾個(gè)小時(shí)。定期檢查匯合點(diǎn)。

　　2. 將生長(zhǎng)因子添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中以獲得以下濃度：0,5,10,20,30和40ng / ml EGF。

　　3. 用無菌鑷子輕輕取出2孔培養(yǎng)插件。要移除培養(yǎng)插件，請(qǐng)抓住一個(gè)角，如圖3所示。

　　4. 用無細(xì)胞培養(yǎng)基或PBS洗滌細(xì)胞層以除去細(xì)胞碎片和未附著的細(xì)胞。

　　5. 小心吸出無細(xì)胞培養(yǎng)基或PBS。

　　6.用移液管將1ml細(xì)胞培養(yǎng)基加到24孔板的每個(gè)孔中。

　　圖3使用無菌鑷子取出2孔培養(yǎng)插件

　　3.1 步驟3：獲取顯微鏡圖像

　　我們建議錄制延時(shí)視頻，以確定時(shí)間依賴性和細(xì)胞遷移的特征。

　　1. 將μ-Plate 24孔培養(yǎng)板放在顯微鏡上并確定所有24個(gè)孔的位置。

　　2. 在接下來的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)多次拍攝圖像，開始觀察過程。在24小時(shí)內(nèi)每30分鐘拍攝一次圖像。

　　4.結(jié)果

　　分析顯微圖像以獲得關(guān)于培養(yǎng)細(xì)胞遷移特征信息。分析細(xì)胞覆蓋區(qū)域隨時(shí)間的變化來確定細(xì)胞速度。

　　圖4 hEGF對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移行為影響的比較。測(cè)試了四種不同的EGF濃度，并與對(duì)照實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了比較。

　　使用Culture-Insert 2 Well 在24孔培養(yǎng)板上進(jìn)行測(cè)試六種不同（或更多）的條件。通過比較細(xì)胞速度與對(duì)照條件的速度來分析五種不同hEGF濃度（每種重復(fù)四次）的影響。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，與對(duì)照組相比，hEGF增加了MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞速度。如圖4所示，hEGF> 10ng / ml的濃度顯示細(xì)胞速度沒有進(jìn)一步增加。